Коммерчески доступные субстраты пероксидазы хрена 3,3’,5,5’-Тетраметилбензидин (англ. TMB ) и 3,3"-Диаминобензидин (англ. DAB ) при окислении дают цветные продукты, а хемилюминесцентные вещества SuperSignal, ECL являются источниками детектируемого света при действии HRP.

Усиление хемилюминесценции (ECL)

Пероксидаза хрена катализирует окисление люминола в 3-аминофталат через серию интермедиатов . Данная реакция сопровождается свечением низкой интенсивности с длиной волны 428 нм. В присутствии некоторых веществ, возможно достичь усиления свечения до тысячи раз. Явление усиления свечения называют усилением хемилюминесценции (англ. enhanced chemiluminescence, ECL ). Наиболее эффективными усилителями являются производные фенолов, например, п-йодфенол. ECL позволяет детектировать около 0,5 пикограмма нуклеиновой кислоты при Саузерн блоттинге .

Напишите отзыв о статье "Пероксидаза хрена"

Примечания

Внешние ссылки

• MeSH Horseradish+peroxidase

Отрывок, характеризующий Пероксидаза хрена

Посидев несколько времени и дотронувшись, сам не зная для чего, рукой до шероховатости блика портрета, он встал и опять позвал Боссе и дежурного. Он приказал вынести портрет перед палатку, с тем, чтобы не лишить старую гвардию, стоявшую около его палатки, счастья видеть римского короля, сына и наследника их обожаемого государя.
Как он и ожидал, в то время как он завтракал с господином Боссе, удостоившимся этой чести, перед палаткой слышались восторженные клики сбежавшихся к портрету офицеров и солдат старой гвардии.
– Vive l"Empereur! Vive le Roi de Rome! Vive l"Empereur! [Да здравствует император! Да здравствует римский король!] – слышались восторженные голоса.
После завтрака Наполеон, в присутствии Боссе, продиктовал свой приказ по армии.
– Courte et energique! [Короткий и энергический!] – проговорил Наполеон, когда он прочел сам сразу без поправок написанную прокламацию. В приказе было:
«Воины! Вот сражение, которого вы столько желали. Победа зависит от вас. Она необходима для нас; она доставит нам все нужное: удобные квартиры и скорое возвращение в отечество. Действуйте так, как вы действовали при Аустерлице, Фридланде, Витебске и Смоленске. Пусть позднейшее потомство с гордостью вспомнит о ваших подвигах в сей день. Да скажут о каждом из вас: он был в великой битве под Москвою!»
– De la Moskowa! [Под Москвою!] – повторил Наполеон, и, пригласив к своей прогулке господина Боссе, любившего путешествовать, он вышел из палатки к оседланным лошадям.
– Votre Majeste a trop de bonte, [Вы слишком добры, ваше величество,] – сказал Боссе на приглашение сопутствовать императору: ему хотелось спать и он не умел и боялся ездить верхом.
Но Наполеон кивнул головой путешественнику, и Боссе должен был ехать. Когда Наполеон вышел из палатки, крики гвардейцев пред портретом его сына еще более усилились. Наполеон нахмурился.
– Снимите его, – сказал он, грациозно величественным жестом указывая на портрет. – Ему еще рано видеть поле сражения.
Боссе, закрыв глаза и склонив голову, глубоко вздохнул, этим жестом показывая, как он умел ценить и понимать слова императора.

Весь этот день 25 августа, как говорят его историки, Наполеон провел на коне, осматривая местность, обсуживая планы, представляемые ему его маршалами, и отдавая лично приказания своим генералам.
Первоначальная линия расположения русских войск по Ко лоче была переломлена, и часть этой линии, именно левый фланг русских, вследствие взятия Шевардинского редута 24 го числа, была отнесена назад. Эта часть линии была не укреплена, не защищена более рекою, и перед нею одною было более открытое и ровное место. Очевидно было для всякого военного и невоенного, что эту часть линии и должно было атаковать французам. Казалось, что для этого не нужно было много соображений, не нужно было такой заботливости и хлопотливости императора и его маршалов и вовсе не нужно той особенной высшей способности, называемой гениальностью, которую так любят приписывать Наполеону; но историки, впоследствии описывавшие это событие, и люди, тогда окружавшие Наполеона, и он сам думали иначе.
Наполеон ездил по полю, глубокомысленно вглядывался в местность, сам с собой одобрительно или недоверчиво качал головой и, не сообщая окружавшим его генералам того глубокомысленного хода, который руководил его решеньями, передавал им только окончательные выводы в форме приказаний. Выслушав предложение Даву, называемого герцогом Экмюльским, о том, чтобы обойти левый фланг русских, Наполеон сказал, что этого не нужно делать, не объясняя, почему это было не нужно. На предложение же генерала Компана (который должен был атаковать флеши), провести свою дивизию лесом, Наполеон изъявил свое согласие, несмотря на то, что так называемый герцог Эльхингенский, то есть Ней, позволил себе заметить, что движение по лесу опасно и может расстроить дивизию.

Около 44,173.9 Да, представляет собой гликопротеид и имеет четыре остатка аминокислоты лизина для соединения с молекулой, которую требуется пометить.

Продукт активности пероксидазы хрена представляет собой цветное или люминесцентное соединение, подходящее для детекции и количественного анализа. HRP часто используют в составе конъюгатов для детекции определенных молекул. Например, в случае вестерн блоттинга используют конъюгаты HRP с антителами против заданных белков или молекул; в данном случае антитело обладает специфичностью к заданной мишени, а HRP образует детектируемый сигнал. . Пероксидазу хрена также используют в таких методиках, как ИФА и для иммуногистохимического анализа.

Пероксидаза хрена представляет собой идеальный фермент для многих методик, так как имеет относительно небольшой размер, относительно стабильна и более дешева, чем альтернативы - например, щелочная фосфатаза . HRP имеет бо льшее количество оборотов в единицу времени и потому обеспечивает развитие достаточно сильного сигнала за относительно небольшой период времени.

Пероксидаза хрена в свободной форме или в виде конъюгатов с другими молекулами требует наличие субстрата для визуализации. HRP окисляет субстрат в присутствии пероксида водорода , при этом образуются продукты, которые можно детектировать спектрофотометрически .

Коммерчески доступные субстраты пероксидазы хрена 3,3’,5,5’-Тетраметилбензидин (англ. TMB ) и 3,3"-Диаминобензидин (англ. DAB ) при окислении дают цветные продукты, а хемилюминесцентные вещества SuperSignal, ECL являются источниками детектируемого света при действии HRP.

Усиление хемилюминесценции (ECL)

Пероксидаза хрена катализирует окисление люминола в 3-аминофталат через серию интермедиатов . Данная реакция сопровождается свечением низкой интенсивности с длиной волны 428 нм. В присутствии некоторых веществ, возможно достичь усиления свечения до тысячи раз. Явление усиления свечения называют усилением хемилюминесценции (англ. enhanced chemiluminescence, ECL ). Наиболее эффективными усилителями являются производные фенолов, например, р-йодофенол. ECL позволяет детектировать около 0,5 пикограмма нуклеиновой кислоты при Саузерн блоттинге .

Примечания

Внешние ссылки

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Пероксидаза хрена" в других словарях:

пероксидаза хрена - — Тематики биотехнологии EN horseradish peroxidase … Справочник технического переводчика

- [[Изображение:|px|Тиреопероксидаза chemical structure]] thyroid peroxidase Обозначения Symbol(s) TPO Entrez … Википедия

Вестерн блот анализ белков, разделенных при помощи градиентного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS. Вестерн блоттинг (белковый иммуноблот, англ. Western blot) аналитический метод, используемый для определения… … Википедия

Вестерн блоттинг (вестерн блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. На первом этапе использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для… … Википедия

- (англ. Peroxiredoxins, Prxs, КФ 1.11.1.15) широкораспространённая семья антиоксидантных ферментов. У млекопитающих ферменты этой группы контролируют уровень цитокин индуцированных пероксидов, участвующих в передаче клеточных сигналов. … … Википедия

Глутатионпероксидазы (ГП) семейство ферментов, защищающих организм от оксидативного повреждения. ГП катализируют распад липидных пероксидаз и перекиси водорода. Известно несколько генов, кодирующих разные формы глутатионпероксидаз, отличающиеся… … Википедия

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства пероксидазы высокого качества из корней хрена для диагностических целей. Измельченную биомассу корней хрена выдерживают в 0.1 М буферном растворе фосфата натрия рН 7.0, предварительно продутом азотом, в присутствии 5 мкМ раствора гемина и 5 мМ хлористого кальция. Экстракт отделяют декантацией с последующей фильтрацией и концентрированием ультрафильтрацией через ультрафильтры с размером пор менее 30 кДа. Экстракт фермента насыщают сульфатом аммония до 35% от насыщения и наносят на колонку с фенилсефарозой, после интенсивного промывания буфера с сульфатом активные фракции снимают градиентом сульфата аммония (35%-0%) и увеличением рН до 8.0. Фермент очищают гель-фильтрацией на Toyopearl HW55F, подвергают диализу и высушивают лиофилизацией. Использование геминсодержащих буферов на стадии экстракции и гель-фильтрации позволяет получать высокоактивный фермент с высоким выходом за счет 100% насыщения фермента гемином. Это позволяет ускорить процесс производства фермента и существенно улучшить его каталитические характеристики и стабильность. 6 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства пероксидазы высокого качества из корней хрена, предназначенной для диагностических целей.

Известен (Paul K.G. The Enzymes. New Jork, Acad. Press, 1963) способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой или солевым раствором и фракционирование экстракта, причем фракционирование осуществляют последовательной обработкой экстракта сульфатом аммония, гель-фильтрацией, спиртовым осаждением, электрофорезом, переосаждением хлоридом аммония, фильтрацией через Сефадекс G 50 и ДЕАЕ-целлюлозу и диализом.

Основными недостатками данного способа являются невысокая чистота и активность полученного препарата, а также сложность и продолжительность процесса его получения. Кроме того, данный способ не предполагает безотходного производства.

Известен также (HU, патент №172872) способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой, фракционирование экстракта сульфатом аммония и его гельфильтрацию.

Недостаток данного способа состоит в недостаточно высоком выходе фермента.

Известен (BG, патент 46675) способ получения фермента из отходов производства, включающий гомогенизацию, экстракцию фермента водой, осаждение экстракта сульфатом аммония, очистку и концентрирование фермента ультрафильтрацией и гель-фильтрацией и последующую лиофилизацию.

Известен также (RU, патент №2130070) способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию растительной ткани хрена, экстракцию фермента, отделение экстракта с проведением осаждения фермента сульфатом аммония, очистку фермента концентрированием ультрафильтрацией и гельфильтрацией, последующую лиофилизацию целевого продукта, причем в качестве растительной ткани хрена используют отходы от зачистки корней при производстве пищевой продукции, перед ультрафильтрацией в экстракт вносят сульфит натрия в эффективном количестве, осаждают фермент сульфатом аммония из ультрафильтрата, а после гель-фильтрации фермент дополнительно очищают ионообменной хроматографией.

Известный способ выбран в качестве ближайшего аналога разработанного изобретения.

Недостатками указанных способов является длительность процесса очистки с потерей активности, что приводит к ухудшению качества, а именно удельной активности, конечного продукта.

Техническая задача, на решение которой направлено разработанное техническое решение, состоит в разработке способа получения пероксидазы, обеспечивающего максимальный выход активного препарата и его высокую удельную активность.

Технический результат, получаемый при реализации разработанного способа, состоит в уменьшении расхода корней хрена и повышении выхода пероксидазы с высокой степенью чистоты и активности, а также в ускорении способа.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию растительной ткани корня хрена, экстракцию фермента, отделение экстракта, очистку фермента гидрофобной хроматографией, концентрированием ультрафильтрацией и гель-фильтрацией, последующую лиофилизацию целевого продукта, причем в экстракт вносят гемин и хлорид кальция, экстракт насыщают азотом путем продувки, а фермент очищают гидрофобной хроматографией.

В некоторых вариантах реализации способа экстракцию фермента производят в 0,1 М буферном растворе фосфата натрия или калия в течение 1 ч при продолжающейся продувке азотом.

Предпочтительно гемин вносят в экстракт до концентрации 5 мкМ, а хлорид кальция вносят в экстракт до концентрации 5 мМ.

В некоторых вариантах реализации гидрофобную хроматографию проводят при добавлении сульфата аммония в количестве 35% от насыщения.

Преимущественно гидрофобную хроматографию проводят на фенилсефарозе с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>1,5, а гельфильтрацию осуществляют на Toyopearl HW55F с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>2,7.

Разработанный способ включает следующую совокупность признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1) гомогенизация растительной ткани;

2) в качестве растительной ткани могут использовать как корни хрена, так и отходы, полученные при зачистке корней хрена при изготовлении пищевой продукции;

3) экстракция фермента;

4) концентрирование экстракта ультрафильтрацией;

5) очистка фермента гидрофобной хроматографией;

6) дополнительная очистка гель-фильтрацией;

7) лиофилизация фермента.

Достижение технического результата при использовании предлагаемого способа объясняется следующим образом.

Экспериментально было установлено, что образование полифенольных пигментов при разрушении биомассы является следствием протекания оксидазной реакции, которая приводит к частичной инактивации пероксидазы. Продувка буфера для экстракции азотом в течение 2 часов обеспечивает снижение концентрации кислорода до 25-30 мкМ и ингибирует образование полифенолов в 10-12 раз. Включение в состав гемина и хлорида кальция приводит к 100% насыщению активного центра гемином и дополнительной стабилизации фермента. Авторами изобретения предложено впервые использовать указанные добавки для изготовления пероксидазы, что позволило снизить расход корней хрена и повысить выход пероксидазы на единицу массы корней при высокой степени ее чистоты и активности.

Ускорение процесса получения пероксидазы достигается за счет введения стадии гидрофобной хроматографии, которая позволяет избавиться от дорогостоящего и трудоемкого осаждения сульфатом аммония. При этом достигается экономия сульфата аммония.

По сравнению с ближайшим аналогом отличительными признаками изобретения являются:

1) использование добавок гемина, хлорида кальция и предварительная продувка экстрагирующего буфера азотом при экстракции фермента;

2) очистка и одновременное концентрирование фермента гидрофобной хроматографией;

3) дополнительная очистка гель-фильтрацией в присутствии добавок гемина и кальция.

В дальнейшем способ будет иллюстрирован примером реализации.

3 кг промытых водой корней хрена измельчают в гомогенизаторе и заливают 3 л 0.1 М буферного раствора фосфата натрия, рН 7.0, в присутствии 5 мкМ раствора гемина и 5 мМ хлористого кальция, причем буферный раствор предварительно продут азотом. Экстрагирование ведут в течение часа. Экстракт отделяют декантацией, выдерживают сутки при 4°С и фильтруют через бумажный фильтр, а затем через ультрафильтры с диаметром пор 0.23 микрона для полного удаления остатков частиц биомассы перед стадией концентрирования. Концентрирование ведут ультрафильтрацией на проточной концентрационной ячейке с фильтром, удерживающим 30 кДа в течение 6 часов. Конечный объем составляет 0.5 л. Далее к раствору фермента добавляют 200 г сульфата аммония (35% от насыщения), выдерживают 3 часа при 4°С, отделяют выпавший осадок центрифугированием при 9000g, а супернатант наносят на колонку с фенилсефарозой, промывают 1 л буферного раствора, содержащего сульфат аммония, и снимают фермент градиентом сульфата аммония (35-0%) с одновременным повышением рН до 8.0. Собирают фракции с величиной параметра RZ>1,5; объем фракции составляет 100 мл.

Фермент дополнительно очищают гель-фильтрацией на 2 л колонке с Toyopearl HW55F, уравновешенной 0.1 М К-фосфатным буфером, рН 7.8, в присутствии 5 мкМ гемина и 5 мМ хлорида кальция. Собирают фракции основного пика (хвостовые фракции могут быть использованы для получения препаратов кислой изоформы пероксидазы хрена) с величиной параметра RZ>2,7; объем фракций составляет 150 мл. Фракции подвергают диализу против 2 л 5 мМ раствора того же буфера, сменяя буферный раствор 4 раза, и лиофильно высушивают. Высушенная пероксидаза имеет вид аморфной массы ярко-коричневого цвета, легко растворяется в водных буферных растворах. Выход фермента составляет 500 мг. Степень чистоты полученного фермента контролируют спектрофотометрически по показателю RZ (отношению величин поглощения на длинах волн 403 и 278 нм), величина которого должна быть не менее 2,7. Ферментативную активность пероксидазы определяют по индикаторной реакции с АБТС. Препарат считают кондиционным, если в 1 мг содержится не менее 1000 единиц активности. Массовую долю влаги определяют по ГОСТ 24061-89.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют, что реализации разработанного способа позволяет обеспечить достижение технического результата - снижение расхода корней хрена и повышение выхода пероксидазы высокой степени чистоты и активности, а также ускорение способа.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют, что реализация разработанного способа позволяет обеспечить достижение технического результата - снижение расхода корней хрена и повышение выхода пероксидазы высокой степени чистоты и активности, а также ускорение способа.

1. Способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию растительной ткани корней хрена, экстракцию фермента, отделение экстракта с последующим концентрированием ультрафильтрацией и гельфильтрацией и лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что между стадиями ультрафильтрации и гельфильтрации фермент очищают гидрофобной хроматографией, причем экстрагирующий буфер предварительно насыщают азотом путем продувки и вносят гемин и хлорид кальция.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию фермента производят в 0,1 М буферном растворе фосфата натрия или калия в течение 1 ч при продолжающейся продувке азотом.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что гемин вносят в экстракт до концентрации 5 мкМ.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что хлорид кальция вносят в экстракт до концентрации 5 мМ.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидрофобную хроматографию проводят при добавлении сульфата аммония 35% от насыщения.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидрофобную хроматографию проводят на фенилсефарозе с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>1,5.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что гельфильтрацию осуществляют на Toyopearl HW55F с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>2,7.

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно к микробиологическому получению ферментных препаратов - лакказ, и может быть использовано при модификации лигниносодержащих материалов и получении из них промышленно ценных соединений, отбеливании бумажной массы и текстильных материалов, очистке сточных вод и почвы от целого ряда ксенобиотиков, полимеризации фенолов и ряда других ароматических соединений, получении косметических препаратов для отбеливания кожи и окрашивания волос.

Изобретение относится к области производства гетерогенных катализаторов процессов жидкофазного окисления органических соединений - фенолов, поверхностно-активных веществ - перекисью водорода и может быть применено для каталитической очистки сточных вод от фенольных соединений.

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам гидролитического расщепления нативного комплекса фермент пероксидаза+фенолы (хиноны), которые могут найти применение при изучении различных метаболических процессов, связанных с действием пероксидазы процессы лигнификации тканей, защитные реакции организмов, иммунологические исследования, при которых используется пероксидаза.

Изобретение относится к области биохимии. Используют липосомы в качестве матрицы для активированного фермента - пероксидазы хрена. К 5 мг окисленной перйодатным методом пероксидазы хрена добавляют 1 мл суспензии липосом в 0,01 М растворе карбонатно-бикарбонатного буфера при рН 9,5. Подвергают ультразвуковой обработке в течение 1 мин. Инкубируют 1 ч. Иммобилизуют с иммуноглобулинами в концентрации 5 мг в течение 2 ч при температуре 22±4°С. Стабилизируют 5 мг боргидрида натрия с последующей гель-хроматографической очисткой. Изобретение позволяет получить липосомально-иммунопероксидазный конъюгат для индикации возбудителей инфекционных заболеваний в иммуноферментном анализе и увеличить срок годности препарата до 6 лет. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к новому способу получения флуоресцирующих катехоламинов, выбранных из допамина и адреналина, и их метаболитов, выбранных из гомованилиновой и ванилилминдальной кислот, методом дериватизации. Соединения могут быть использованы в качестве высокочувствительных и селективных маркеров для определения различный заболеваний. Способ дериватизации включает окисление исходных соединений и их взаимодействие с образующими конденсированные структуры аминами в среде CAPS-буферного раствора или глицин - КОН 0.1 мМ пероксидом водорода в присутствии в качестве катализатора пероксидазы хрена. Предпочтительно процесс проводят в 0,1 М буферном растворе при концентрации пероксидазы хрена 0,01-1 мкМ; концентрации пероксида водорода - 100 мкМ, концентрации амина - 0,1-33 мМ; концентрации катехоламинов и метаболитов - 0,03-1 мкМ. Способ является простым и технологичным, т.к. не требует повышенной температуры и осуществляется в водном растворе. 1 з.п.ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой применение оксидоредуктазы перекиси водорода для получения фармацевтической композиции для улучшения качества спермы или лечения мужского бесплодия, где оксидоредуктаза перекиси водорода представляет собой белок PRDX2. Изобретение относится также к композиции для улучшения качества спермы или лечения мужского бесплодия, содержащей белок PRDX2 и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение позволяет эффективно улучшить качество спермы или эффетивно лечить мужское бесплодие пациента, страдающего от астеноспермии. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 10 пр.

Изобретение относится к химической промышленности, а именно к области производства гетерогенных катализаторов процессов жидкофазного окисления органических соединений (в том числе, производных фенолов) и может быть применено на предприятиях различных отраслей промышленности для проведения реакций окисления, а также для каталитической очистки сточных вод от токсичных органических контаминантов. Гетерогенный катализатор жидкофазного окисления органических соединений содержит носитель, глутаровый диальдегид в качестве сшивающего агента и экстракт корня хрена (Armoracia Rusticana) в качестве активного компонента. Согласно изобретению в качестве носителя используют диоксид титана, модифицированный последовательно 0,095÷0,105 н. раствором соляной кислоты, 0,195÷0,205%-ным раствором хитозана в 0,0045÷0,0055 М растворе соляной кислоты и 4,95÷5,05%-ным раствором аминопропилтриэтоксисилана в 95,5÷96,5%-ном этаноле при следующем соотношении компонентов, % масс.: диоксид титана - 45÷55; хитозан - 7,5÷12,5; аминопропилтриэтоксисилан - 17,5÷22,5; сшивающий агент (глутаровый диальдегид) - 7,5÷12,5; активный компонент (экстракт корня хрена) - 7,5÷12,5. Технический результат - повышение активности, селективности и операционной стабильности гетерогенного катализатора в реакции жидкофазного окисления органических соединений перекисью водорода. 6 ил., 19 пр.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства пероксидазы высокого качества из корней хрена для диагностических целей

• Специальность ВАК РФ03.00.23
• Количество страниц 106

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И НОВЫЕ ПРИМЕНЕНИЯ НАТИВНЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЕРОКСИДАЗ.

1.1. Введение.

1.2. Кристаллические структуры пероксидаз.

1.3. Кислотно-основной катализ пероксидаз.

1.4. Металл-связывающие сайты.

1.5. Архитектура активного центра ПХ.

1.5.1 Структура дистальной области ПХ и система водородных связей.

1.5.2. Структура проксимальной области ПХ и система водородных связей.

1.5.3. Сайт связывания ароматических субстратов.

1.6. Роль белкового окружения в пероксидазном катализе.

Глава 2. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗ.

2.1 Использование пероксидаз в)й1ушуноферментном анализе.

2.2. Биохимический анализ физиологически активных веществ.

2.3. Использование пероксидаз в биосенсорах.

2.4. Применение пероксидаз в биотрансформациях.

2.5. Использование пероксидаз для биоотбеливания в целлюлозно-бумажной промышленности.

Глава 3. ВЫДЕЛЕНИЕ, РЕНАТУРАЦИЯ И ОБРАЗОВАНИЕ

ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ, ЭКСПРЕССИРОВАННЫХ В КЛЕТКАХ E.coli В ТЕЛАХ ВКЛЮЧЕНИЯ.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Реагенты.

4.2. Методы исследования.

4.2.1 Клонирование рекомбинантных форм ПХ.

4.2.2 Получение рекомбинантного конъюгата ПХ с БПЖК.

4.2.3 Экспрессия рекомбинантной ПХ в клетках E.coli.

4.2.4 Протоколы рефолдинга и очистки рекомбинантной ПХ.

4.2.5 Физико-химические свойства рекомбинантных форм ПХ.

4.2.6 Адсорбционные и электрохимические измерения.

4.2.7 Расчет структурных изменений в мутантных формах пероксидазы хрена.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 5. ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА

В КЛЕТКАХ E.coli: ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ, РЕФОЛДИНГА, РЕАКТИВАЦИИ И ОЧИСТКИ.

5.1. Экспрессия ПХ в периплазматическую область клеток E.coli BL21(DE3).

5.2. Оптимизация системы рефолдинга ПХ из тел включения при экспрессии в цитоплазматическую область клеток E.coli BL21(DE3)pLysS.

5.3. Свойства рекомбинантной ПХс 6xHis на С-конце.

5.4. Получение и свойства мутантных форм ПХ.

Глава 6. АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ

РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ ПХ.

6.1 Амперометрическое определение Н2О2.

6.2 Стабильность сигнала биосенсора.

6.3 Разработка биферментных биосенсоров.

Глава 7. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО КОНЪЮГАТА

ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА С БПЖК.

7.1 Клонирование и экспрессия рекомбинантного конъюгата ПХ-БПЖК в клетках E.coli.

7.2 Физико-химические и иммунологические свойства рекомбинантного конъюгата ПХ-БПЖК.

V. ВЫВОДЫ.

Рекомендованный список диссертаций

• Иммуноферментный анализ белка, связывающего жирные кислоты на основе рекомбинантных реагентов 2004 год, кандидат химических наук Андреева, Ирина Петровна

• Рекомбинантная пероксидаза табака: получение и каталитические свойства 2007 год, кандидат химических наук Хушпульян, Дмитрий Михайлович

• Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым эффектом 2007 год, кандидат химических наук Савватеева, Людмила Владимировна

• Конформационные различия нативной и рекомбинантной форм изофермента С пероксидазы хрена, выявляемые радиохимическими и кинетическими методами

• Изучение организации фосфат-связывающей области бактериальных уридинфосфорилаз 2000 год, кандидат биологических наук Чеботаев, Дмитрий Владимирович

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение, свойства и применение рекомбинантной пероксидазы хрена»

Изофермент С пероксидазы хрена (ЕС 1.11.1.7)- гликопротеин, молекулярная масса 44 кДа, относится к суперсемейству растительных пероксидаз , содержит простетическую группу протопорфирин-IX, два иона Са2+. ПХ катализирует одноэлектронное окисление большого числа органических и неорганических субстратов пероксидом водорода. ПХ нашла широкое применение в аналитической биохимии и биотехнологиии в качестве маркера антител, ДНК и низкомолекулярных соединений (аналитов).

В последние годы прогресс, достигнутый в клонировании и гетерологической экспрессии генов ПХ, открывает новые возможности по изучению структурно-функциональных взаимосвязей методами белковой инженерии.

Для получения рекомбинантной ПХ широкое распространение нашла система экспрессии в клетках E.coli. Существуют и другие способы экспрессии, такие как экспрессия в клетках насекомых , позволяющая получать фермент в активной, растворимой и гликозилированной форме, а также экспрессия в дрожжах . Однако, эти системы экспрессии достаточно дороги и трудоемки, кроме того, система экспрессии в клетках насекомых не поддается масштабированию, поэтому они и не нашли такого широкого распространения, как экспрессия в клетках E.coli.

Рекомбинантная ПХ экспрессируется в клетках E.coli в нерастворимой, неактивной форме в телах включения. Процесс рефолдинга и реактивации апо-пероксидазы простетической группой многостадийный и достаточно трудоемкий.

Для прикладного применения, такого как, например, использования в биосенсорах, необходим более эффективный и надежный способ получения рекомбинантной ПХ. Таким образом, одной из основных задач данной работы был поиск путей оптимизации ранее описанных протоколов рефолдинга, реактивации и очистки рекомбинантной ПХ, а также исследование возможности периплазматической экспрессии для получения растворимого, активного фермента.

Высокая каталитическая активность ПХ в реакции восстановления пероксида водорода позволяет использовать пероксидазу в качестве высокоэффективного биоэлектрокатализатора, участвующего в прямом переносе электрона между электродом, активным центром фермента и субстратом. В присутствии субстрата при некотором потенциале электрода наблюдается пропорциональность между измеряемым током восстановления и концентрацией Н2О2. При этом эффективность прямого (безмедиаторного переноса электрона) является одним из важнейших условий разработки амперометрических биосенсорных систем на основе ПХ. Из всего вышеизложенного органически вытекает следующая цель настоящей работы -модификация поверхности рекомбинантной ПХ методами сайт-направленного мутагенеза функциональными группами для обеспечения эффективной ориентированной иммобилизации молекулы ПХ на поверхности электродов. В работе была предложена стратегия введения коротких олигогистидиновых последовательностей в поверхностные участки ПХ, что с одной стороны должно было обеспечить эффективную очистку рекомбинантного фермента с использованием металл-хелатной хроматографии (Ni-NTA агароза), и в то же время способствовать эффективной адсорбции соответствующих мутантов на поверхности золотых электродов (известно, что гистидины необратимо сорбируются на золоте).

Пероксидаза хрена нашла широкое применение в качестве фермента-маркера для иммуноферментного анализа. Химическое коньюгирование белков и гаптенов, приводят к частичной инактивации фермента и гетерогенности конъюгатов, что в свою очередь, оказывает влияние на специфичность и чувствительность анализа.

С развитием генной инженерии появилась возможность создавать рекомбинантные конъюгаты фермента маркера с антителами и белковыми антигенами. Такие конъюгаты обладают рядом преимуществ по сравнению с химически полученными, в частности, они гомогенны по составу, имеют 1:1 стехиометрию и воспроизводимы. Кроме того, рекомбинантные конъюгаты сохраняют 100 % как ферментативную, так и иммунологическую активность.

Достижения последних лет в гетерологической экспрессиии ПХ в клетках E.coli и реактивации рекомбинантной пероксидазы хрена дают возможность получения рекомбинантных конъюгатов с пероксидазой в качестве фермента-маркера и применения их в иммуноферментном анализе. Целью данного этапа работы было получение рекомбинантного конъюгата пероксидазы хрена с белком-переносчиком жирных кислот из серца человека (БПЖК) (human heart-type fatty acid binding protein, FABP). БПЖК - является новым высокоспецифичным маркером инфаркта миокарда. Получение рекомбинантного конъюгата ПХ с БПЖК позволит создать новые экспресс-системы для диагностики инфаркта миокарда.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Похожие диссертационные работы по специальности «Биотехнология», 03.00.23 шифр ВАК

• Конформационные различия нативной и рекомбинантных форм изофермента С пероксидазы хрена, выявляемые радиохимическими и кинетическими методами 2002 год, кандидат химических наук Чубарь, Татьяна Анатольевна

• Рекомбинантные аналоги ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты бактерии Brevundimonas diminuta 2009 год, кандидат биологических наук Закирова, Светлана Анатольевна

• Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств 2009 год, кандидат биологических наук Рябченко, Александр Владимирович

• Повышение противоопухолевой активности цитокина TRAIL путем изменения аминокислотного состава белка 2010 год, кандидат биологических наук Яголович, Анна Валерьевна

• Использование бета-спирального домена и пептидил-пролил изомеразы для получения фибриллярного адгезина бактериофага Т4 2012 год, кандидат биологических наук Чупров-Неточин, Роман Николаевич

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Григоренко, Виталий Георгиевич

1. При экспрессии рекомбинантной пероксидазы хрена в переплазму клеток E.coli штамм BL21(DE3) с экспрессионным вектором pETpelHRPhis образуется растворимый, функционально активный фермент с общим выходом около 0,5 мг белка с 1 литра культуры клеток.

2. Цитоплазматическая система экспрессии рекомбинантной ПХ в клетках E.coli штамм BL21(DE3)pLysS с экспрессионным вектором pETHRPhis обеспечивает высокий уровень экспрессии ПХ в форме тел включения (целевой продукт составляет около 30% суммарного клеточного белка клетки). Введение гексагистидиновой последовательности (6xHis) в С- концевую область ПХ позволило эффективно осуществить метал-хелатную хроматографию для выделения и очистки рекомбинантного препарата фермента.

3. На основе данных о влиянии различных реагентов (мочевина, имидазол, глутатион,.) на свойства ПХ, была разработана новая схема рефолдинга и реактивации рекомбинантной ПХ из тел включения, позволяющая получить активный холо-фермент, с выходом 8-10 мг с 1 литра культуры E.coli.

4. Показано, что введение гексагистидиновых последовательностей в N- и С-концевые области фермента, а также замена посредством сайт направленного мутагенеза аминокислотных остатков двух внутренних поверхностных участков (57-61) и (211-216) на гистидиновые соответственно, с разной степенью влияет на каталитические свойства рекомбинантной ПХ.

5. Золотые электроды, модифицированные рекомбинантными формами ПХ, проявляют высокий и стабильный амперометрический сигнал биоэлектрокаталитического восстановления Н2О2 вследствие эффективного прямого переноса электронов между поверхностью золота и активным центром фермента, что служит основой для создания универсального сенсора на Н2О2, а также для создания биферментных сенсоров, основанных на со-иммобилизации ПХ и соответствующих Н2О2- образующих оксидаз (лизин-оксидаза, глюкоз-оксидаза,.).

6. Рекомбинантный конъюгат пероксидазы хрена с белком-переносчиком жирных кислот из сердца человека (БПЖК) обладает как каталитическими свойствами ПХ, так и иммуногенными свойствами БПЖК, что позволяет использовать его в иммуноферментном анализе. Выход целевого продукта составил 12 мг с 1 литра культуры E.coli.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Григоренко, Виталий Георгиевич, 2001 год

1. Welinder, K.G. (1992) Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases. Curr. Opin. Struct. Biol., 2:388-393.

2. Dunford, H.B. and Stillman, J.S. (1976) On the function and mechanism of action of peroxidases, Coordination Chemistry Reviews, 19, 187-251

3. English, A.M., Tsaprailis, G. (1995) Catalytic structure-function relationships in heme peroxidases. Adv.Inorg. Chem., 43:79-125

4. Welinder, K.G. Covalent structure of the glycoprotein horseradish peroxidase (EC1.11.1.7). FEBSLett., 1976. 72: p. 19-25.

5. Dunford, H.B. Horseradish peroxidase: structure and kinetic properties, in Peroxidase in chemistry and Biology, J. Everse, K.E. Everse, and M.B. Grisham, Editors. 1992, CRC Press: Boca Raton, Florida, p. 1-24.

6. Kim, B.B. Pisarev, Y.Y. Egorov, A.M. A comparative study of peroxidases from Horseradish and Arthromyces Ramosus as labels in luminol-mediated chemiluminescent assay. Anal.Biochem., 1991. 199: p. 1-6.

7. Chiswell, D.J. and Ortlepp S.A. (1989) DNA sequence coding for HRP enzyme. European patent No EP0299682

8. Ortlepp, S.A., Pollard-Knight, D. and Chiswell, D.J. (1989) Expression and characterization of a protein specified by a synthetic horseradish peroxidase gene in Escherichia coli. J. Biotech., 11, 353-364.

9. Newmyer, S.L., Sun, J., Loehr, T.M., De Montellano P.R.O. Rescue of the horseradish peroxidase His-170->Ala mutant activity by imidazole: Importance of proximal ligand tethering. Biochemistry, 1996.35(39): p. 12788-12795.

10. Newmyer, S.L., De Montellano, P.R.O. Rescue of the catalytic activity of an H42A mutant of horseradish peroxidase by exogenous imidazoles. Journal of Biological Chemistry, 1996. 271(25): p. 14891-14896.

11. Tanaka, M., Ishimori, K., Morishima, I. The distal glutamic acid as an acid-base catalyst in the distal site of horseradish peroxidase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996. 227(2): p. 393-399.

12. Howes, B.D., Rodriguezlopez, J.N., Smith, А.Т., Smulevich, G. Mutation of distal residues of horseradish peroxidase: Influence on substrate binding and cavity properties. Biochemistry, 1997.36(6): p. 1532-1543.

13. Holzbaur, I.E., English, A.M., Ismail, A.A. Infrared spectra of carbonyl horseradish peroxidase and its substrate complexes: Characterization of pH-dependent conformers. Journal of the American Chemical Society, 1996. 118(14): p. 3354-3359.

14. Gilfoyle, D.J., Rodriguezlopez, J.N., Smith, A.T. Probing the aromatic-donor-binding site of horseradish peroxidase using site-directed mutagenesis and the suicide substrate phenylhydrazine. European Journal of Biochemistry, 1996. 236(2): p. 714-722.

15. Gazaryan, I.G., Galkin, A.G., Doseeva, V.V., Tishkov, V.I. Production and catalytic properties of Phe41->His and Phel43->Glu single-point mutants of horseradish peroxidase expressed in E-coli. Biochemistry Moscow, 1995. 60(10): p. 1187-1192.

16. Nagano, S., Tanaka, M., Watanabe, Y., Morishima, I. Putative hydrogen bond network in the heme distal site of horseradish peroxidase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1995.207(1): p. 417-423.

17. Nagano, S., Tanaka, M., Ishimori, K., Watanabe, Y., Morishima, I. Catalytic roles of the distal site asparagine-histidine couple in peroxidases. Biochemistry, 1996. 35(45): p. 14251-14258.

18. Ozaki S., De Montellano, P.R.O. Molecular engineering of horseradish peroxidase: Thioether sulfoxidation and styrene epoxidation by Phe-41 leucine and threonine mutants. Journal of the American Chemical Society, 1995. 117(27): p. 7056-7064.

19. Tarns J.W., Welinder, K.G. Deglycosylation of Horseradish Peroxidase, in Biochemical, Molecular, and Physiological Aspects of Plant Peroxidases, J. Lobarzewski, et al., Editors. 1991, Printed by Imprimerie Nationale: Geneve, p. 111-114.

20. Egorov, A.M., Kim, B.B., Pisarev, Y.Y., Kapeliuch, Yu.L., Gazaryan I.G. Fundamental and applied aspects of reaction of enhanced chemiluminescence. in Bioluminescence and Chemiluminescence: Status Report. 1993. Chichester: John Wiley & Sons.

21. Banci, L. Structural properties of peroxidases. J. Biotechnol., 1997, 53,253-263.

22. Patterson, W.R., Poulos, T.L. (1995) Crystal structure of recombinant pea cytosolic ascorbate peroxidase. Biochemistry, 34: 4331-4341

23. Schuller, D.J., Ban N, Van Huystee, R.B., McPherson, A., Poulos, T.L. (1996) Crystal structure of peanut peroxidase. Structure, 4:311-321.

24. Gajhede, M., Schuller, D.J., Henriksen, A., Smith, A.T. and Poulos, T.L. (1997) Crystal structure of horseradish peroxidase С at 2.15 A resolution. Nature Structural Biology, 4, 12, 1032-1038.

25. Henriksen, A., Welinder, K.G., Gajhede, M. (1998) Structure of barley grainperoxidase refined at 1.9 A resolution. A plant peroxidase reversibly inactivated at neutral pH. J. Biol. Chem., 273, 2241-2248.

26. Savenkova, M.I., Newmyer, S.L., Ortiz de Montellano, P.R. Rescue of His42-Ala horseradish peroxidase by a Phe41-His mutation. Engineering of surrogate catalytic histidine. J.Biol.Chem. 1996, 271, 24598-24603.

27. Tanaka, M., Ishimori, K., Mukai, M., Kitagawa, Т., Morishima, I. Catalytic activities and structural properties of horseradish peroxidase distal His42-Glu or Gin mutant. Biochemistry, 1997, 36, 9889-9898.

28. Tanaka, M., Nagano, S., Ishimori, K., Morishima, I., (1997) Hydrogen bond network in distal site of peroxidases: Spectroscopic properties of Asn70-Asp horseradish peroxidase mutant. Biochemistry, 36, 9791-9798.

29. Rodriguez-Lopez, J.N., Smith, A.T., Thorneley, R.N.F., (1996) Role of Arg38 in horseradish peroxidase. A critical residue for substrate binding and catalysis. J. Biol. Chem., 271, 4023-4030.

30. Folkes, L.K., Candeas, L.P. (1997) Interpretation of the reactivity of peroxidase compounds I nad II with phenols by Marcus equation. FEBS Lett., 412, 305-308.

31. Nie, G.J., Aust, S.D. (1997) Spectral changes of lignin peroxidase during reversible inactivation. Biochemistry, 36, 5113-5119.

32. Smulevich, G. et.al. (1994) Characterization of recombinant horseradish peroxidase С and three site directed mutants, F41V, F41W and R38K by resonance Raman spectroscopy. Biochemistry, 33, 7398-7400.

33. Veitch, N.C. & Williams, R.J.P. (1990) Two dimensional "H-NMR studies of horseradish peroxidase С and its interaction with indole-3-propionic acid. Eur. J. Biochem., 189, 351-362.

34. Ruzgas Т., Gorton L., Emneus J., Marco-Varga G. (1995) Kinetic models of horseradish peroxidase action on a graphite electrode, J. Electroanal. Chem., 391,41-49.

35. Lindgren A., Tanaka M., Ruzgas Т., Gorton L., Gazaryan I., Ishimori K., Morishima I. (1999) Direct electron transfer catalysed by recombinant forms of horseradish peroxidase: insight into the mechanism. Electrochem. Commun., 1, 171-175.

36. Presnova, G., Grigorenko, V., Egorov, A., Ruzgas Т., Lindgren A., Gorton L., Borchers, Т., (2000), Direct heterogeneous electron transfer of recombinant horseradish peroxidases on gold. Faraday Discuss., 116, 281-289

37. Ferapontova, E.E., Grigorenko, V.G., Egorov, A.M., Borchers, Т., Ruzgas Т., Gorton L., (2001) Direct Electron Transfer in the SystemGold Electrode -Recombinant Horseradish Peroxidases. J.Electroan. Chem.

38. Lindbladh, C.; Mosbach, K.; Bulow, L. (1993), Use of genetically prepared enzyme conjugates in enzyme immunoassay.Trends Biochem. Sci., 8, 279-283.

39. Porstman. Т.; Kiessig, S. T. J. (1992) Enzyme immunoassay techniques. An overview.

40. J. Immunol. Methods, 150, 5-21.

41. Wittkowski, A.; Daunert, S.; Kindy, M. S.; Bachas, L. G. (1993), Enzyme-linked immunosorbent assay for an octapeptide based on a genetically engineered fusion protein. Anal. Chem., 65, 1147-1151.

42. Schreiber, A.; Specht, В.; Pelsers, M. M. A. L.; Glatz, J.F.C.; Borchers, Т.; Spener, F. (1998) Recombinant human heart-type fatty acid-binding protein as standard in immunochemical assays. Clin. Chem. Lab. Med., 36,283-288.

43. Grigorenko VG, Chubar ТА, Kapeliuch YuL, Borchers T, Spener, F. and Egorov, A.M., (1999) New approaches for functional expression of recombinant horseradish peroxidase С in Escherichia Coli., Biocatalysis and Biotransformation, 17, 359-379.

44. Grigorenko, V., Andreeva, I., Borchers, Т., Spener, F. and Egorov A.M. A genetically engineered fusion protein with horseradish peroxidase as a marker enzyme for use in competitive immunoassays. (2001) Anal.Chem., 73, 11341139.

45. Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. and Dubendorf, J.W. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods in Enzymology, 185, 60-89.

46. George, P. (1953) The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome с peroxidase and horseradish peroxidase. Biochemical Journal, 54, 267-271.

47. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254

48. Fuhrhop, J.-H. and Smith, K.M. (1975) Laboratory Methods. In Porphyrins and Metalloproteins (ed. K.M. Smith). Elsevier, Amsterdam, pp 757-869.

49. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

50. Hartmann, C., Ortiz de Montellano, P.R. (1992) Baculovirus expression and characterization of catalytically active horseradish peroxidase. Archives of Biochemistry and Biophysics, 297, 61 -72.

51. Morawski В., Lin Z„ Cirino P., Joo H„ Bandara G, Arnold F.H. (2000) Functional expression of horseradish peroxidase in Saccharomyces cerevisiae and Pichiapastoris. Protein. Eng., 13(5), 377-84.

52. Freedman, R.B. (1995) The formation of protein disulphide bonds. Current Opinion in Structural Biology, 5, 85-91.

53. Skerra, A. and Pliickthun, A. (1988) Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science, 240, 1038-1041.

54. Le, H. V. and Trotta, P .P. (1991) Purification of secreted recombinant proteins from Escherichia coli. Bioprocess Technology, 12,163-181.

55. Gillet, D., Ducancel, F., Pradel, E., Leonetti, M., Menez, A. and Boulain, J.C. (1992) Insertion of a disulfide-containing neurotoxin into E. coli alkaline phosphatase: the hybrid retains both biological activities. Protein Engineering, 5, 273-278.

56. Ouzzine, M., Boyd, A. and Hulmes, D.J. (1996) Expression of active, human lysyl oxidase in Escherichia coli. FEBS Letters, 399, 215-219.

57. Berezin, I.V., Ugarova, N.N., Kershchengolts, B.M., Brovko, L.I.U. (1975) Effect of prosthetic group of horseradish peroxidase on enzyme stability (in Russian) Biokhimiia 40, 297-301

58. Hargrove, M.S., Krzywda, S., Wilkinson, A.J., Dou, Y., Ikeda-Saito, M. and Olson, J.S. (1994) Stability of myoglobin: a model for the folding of heme proteins. Biochemistry, 33, 11769-11775.

59. Tams J.W. and Welinder K.G. (1995) Mild chemical deglycosylation of horseradish peroxidase yields a fully active, homogeneous enzyme. Analytical Biochemistry, 228, 48-55

60. Smith, A.T. Santana, N., Dacey, S., Edwards, M., Bray, R.C., Thorneley, R.N.F. and Burke, J.F. (1990) Expression of a synthetic gene for horseradish peroxidase

61. С in Escherichia coli and folding and activation of the recombinant enzyme with2+

62. Ca and heme. Journal of Biological Chemistry, 265, 1335-13343.

63. Howes, B.D., Rodriguez-Lopez, J.N., Smith, A.T. and Smulevich, G. (1997) Mutation of distal residues of horseradish peroxidase: influence on substrate binding and cavity properties. Biochemistry, 36, 1532-1543.

64. Dalton, D.A., Diaz del Castillo, L., Kahn, M.L., Joyner, S.L. and Chatfield, J.M. (1996) Heterologous expression and characterization of soybean cytosolic ascorbate peroxidase. Archives of Biochemistry and Biophysics, 328, 1-8.

65. Phelps, С., Antonini, E. (1969) The combination of carbon monoxide-haem with apoperoxidase. Biochemical Journal, 114, 719-724.

66. Rubtsova, M.Y., Kovba, G.V. and Egorov, A.M. (1998) Chemiluminescent biosensors based on porous supports with immobilized peroxidase. Biosensors & Bioelectronics, 13, 75-85.

67. Nakane P.K., Pierce G.B. (1967) Enzyme-labeled antibodies for the light and electron microscopic localization of tissue antigens. J. Cell Biol., 33, 307-318.

68. Avrameas S., Uriel J. (1966) Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. CR Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545.

69. Miles L.E. (1968) Labelled antibodies and immunological assay systems. Nature, 219, 186-189.

70. Engvall E., Perlmann P. (1971) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8, 871-874.

71. Frey A., DiGanzio J, Zurakowski D. (1998) A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. J. Immunol. Methods, 221, 35-41.

72. Farr A.J., Nakane P.K. (1981) Immunohistochemistry with enzyme labeled antibodies: a brief review. J. Immunol. Method, 47, 129-144.

73. Ishikawa E., Imagawa M., Hashida S., Yoshitake S., Hamaguchi Y., Ueno T. (1983) Enzyme-labeling of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunohistochemical staining. J. Immunoassay, 4, 209-327.

74. Pundir C.S., Kuchhal N.K., Bhargava A.K. (1998) Determination of urinary oxalate with oxalate oxidase and peroxidase immobilized on to glass beads. Biotechnol. Appl. Biochem., 27, 103-107.

75. Kuhlmann W.D., Pesche P. (1986) Glucose oxidase as label in histological immunoassays with enzyme-amplification in a two-step technique: coimmobilized horseradish peroxidase as secondary system enzyme for chromogen oxidation. Histochemistry, 85, 13-17.

76. Trivedi R.C., Rebar L., Berta E., Stong L. (1978) New enzymatic method for serum uric acid at 500 nm. Clin. Chem., 24, 1908-1911.

77. Ternaux J.P., Chamoin M.C. (1994) Enhanced chemiluminescent assays for acetylcholine. J. Biolumin. Chemilumin., 9, 65-72.

78. Guo J.A., Mo P.S., Li G.X. (1990) Immobilization of glucose oxidase and peroxidase and their application in flow-injection analysis for glucose in serum. Appl. Biochem. Biotechnol., 23, 15-24.

79. Elekes O., Moscone D., Venema K., Korf J. (1995) Bi-enzyme reactor for electrochemical detection of low concentrations of uric acid and glucose. Clin. Chim. Acta., 239, 153-165.

81. Zhao J., Henkens R.W., Crumbliss A.L. (1996) Mediator-free amperometric determination of toxic substances based on their inhibition of immobilized horseradish peroxidase. Biotechnol. Prog., 12, 703-708.

82. Ruzgas Т., Csoregi E., Emneus J., Gorton L., Marko-Varga G. (1996) Peroxidase-modified electrodes: Fundamentals and application. Anal. Chim. Acta, 330, 123-138.

83. Ferri Т., Poscia A., Santucci R. (1998) Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase. Part II: Amperometric detection of hydrogen peroxide.,

84. Bioelectrochem. Bioenerg., 45, 221-226.

85. Wang B, Li B, Wang Z, Xu G, Wang Q, Dong S (1999) Sol-gel thin-film immobilized soybean peroxidase biosensor for the amperometric determination of hydrogen peroxide in acid medium. Anal. Chem., 71, 1935-1939.

86. Adam W, Lazarus M, Saha-Moller CR, Weichold O, Hoch U, Haring D, Schreier P (1999) Biotransformations with peroxidases. In: Adv Biochem Engineering Biotechnology, Th Scheper, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 63,73-108.

87. Doerge DR, Divi RL, Churchwell MI (1997) Identification of the colored guaiacol oxidation product produced by peroxidases. Anal. Biochem., 250, 1017.

88. Colonna S., Gaggero N., Richelmi C., Pasta P. (1999) Recent biotechnological developments in the use of peroxidases. Trends Biotechnol., 17, 163-168.

89. Thomas J.A., Morris D.R., Hager .LP. (1970) Chloroperoxidase. Formation of peroxide and halide complexes and their relation to the mechanism of the halogenation reaction. J. Biol. Chem., 245, 3129-3142.

90. Dawson J,H, (1988) Probing structure-function relations in heme-containing oxygenases and peroxidases. Science, 240,433-439.

91. Ortiz De Montellano P.R. (1992) Catalytic sites of hemoprotein peroxidases. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32, 89-107.

92. Ricard J., Job D. (1974) Reaction mechanisms of indole-3-acetate degradation by peroxidases. A stopped-flow and low-temperature spectroscopic study. Eur. J. Biochem., 44, 359-374.

93. Smith A.M., Morrison W.L., Millham P.J. (1982) Oxidation of indole-3-acetic acid by peroxidase: involvement of reduced peroxidase and compound III with superoxide as a product. Biochemistry, 21,4414-4419.

94. Nakajima R., Yamazaki I. (1979) The mechanism of indole-3-acetic acid oxidation by horseradish peroxidases. J. Biol. Chem., 254, 872-878.

95. Mottley C, Mason RP (1986) An electron spin resonance study of free radical intermediates in the oxidation of indole acetic acid by horseradish peroxidase. J. Biol. Chem., 261, 16860-16864.

96. Dordick J.S., Klibanov A.M., Martella M.A. (1986) Horseradish peroxidase catalyzed hydroxylations: mechanistic studies. Biochemistry, 25, 2946-2951.

97. Kauffmann C., Petersen B.R., Bjerrum M.J. (1999) Enzymatic removal of phenols from aqueous solutions by Coprinus cinereus peroxidase and hydrogen peroxide. J. Biotechnol., 73, 71-74.

98. Al-Kassim L., Taylor K.E. (1994) Enzymatic removal of selected aromatic contaminants from wastewater by a fungal peroxidase from Coprinus macrorhizus in batch reactors. J. Chem. Tech. Biotechnol., 61, 179-182.

99. Sakharov I.Yu., Castillo J.A., Areza J.C., Galaev I.Yu. (2000) Purification and stability of peroxidase of African oil palm Elaies guineensis. Bioseparation, 9, 125-132.

100. Ferrari R.P., Laurenti E., Trotta F. (1999) Oxidative 4-dechlorination of 2,4,6-trichlorophenol catalyzed by horseradish peroxidase. J. Biol. Inorg. Chem., 4, 232-237.

101. Kim S.J., Shoda M. (1999) Purification and characterization of a novel peroxidase from Geotrichum candidum dec 1 involved in decolorization of dyes. Appl. Environ. Microbiol., 65,1029-1035.

102. Peterhans, A.; Mecklenburg, M.; Meussdoerffer, F.; Mosbach, K. (1987) A simple competitive enzyme-linked immunosorbent assay using antigen-beta-galactosidase fusions. Anal. Biochem., 163, 470-475.

103. Ann. N. Y. Acad. Sci., 646, 125-135.

104. Lindbladh, C.; Persson, M.; Bulow, L.; Stahl, S.; Mosbach, K. (1987) The design of a simple competitive ELIS A using human proinsulin-alkaline phosphatase conjugates prepared by gene fusion. Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 607-614.

105. Gillet, D.; Ezan, E.; Ducancel, F., Gaillard, C.; Ardouin, Т.; Istin, M.; Menez, A.; Boulain, J.-C.; Grogent, J.-M. (1993) Enzyme immunoassay using a rat prolactin-alkaline phosphatase recombinant tracer. Anal. Chem., 65, 1779-1784.

106. Lewis, J. C.; Daunert, S. (1999) Dual detection of peptides in a fluorescence binding assay by employing genetically fused GFP and BFP mutants. Anal. Chem., 71,4321-4327.

107. Lindbladh, С.; Mosbach, К.; Bulow, L. (1991) Preparation of a genetically fused protein A/luciferase conjugate for use in bioluminescent immunoassays. J. Immunol. Methods, 137, 199-207.

108. Gillet, D.; Ducancel, F.; Pradel, E.; Leonetti, M.; Menez, A.; Boulain, J. C. (1992) Insertion of a disulfide-containing neurotoxin into E. coli alkaline phosphatase: the hybrid retains both biological activities. Protein Eng., 5, 273278.

109. Chanussot, C.; Bellanger, L.; Ligny-Lemaire, C.; Seguin, P.; Menez, A.; Boulain, J. C. (1996) Engineering of a recombinant colorimetric fusion protein for immunodiagnosis of insulin. J. Immunol. Methods, 197, 39-49.

110. Kerschbaumer, R. J.; Hirschl, S.; Schwager, C.; Ibl, M.; Himmler, G. (1996) pDAP2: a vector for construction of alkaline phosphatase fusion-proteins. Immunotechnology, 2, 145-150.

111. Karlsson, R.; Michaelsson, A.; Mattsson, L. (1991) Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system. J. Immunol. Methods, 145, 229-240.

112. A.M. Egorov, E.M. Gavrilova and I.Yu. Sakharov (2000) Applications of peroxidases in modern biotechnology, In Integrated Plant Systems, H. Greppin et al., eds. University of Geneva, pp. 1-18

113. Krueger, J.K., Stock, A.M., Schutt, C.E., Stock, J.B. 1990. Inclusion bodies from proteins produced at high levels in E.coli, pp. 136-142. L.M. Gierasch and J. King (eds.), Protein folding, American Association for Advances in Science, Washington.

114. Marston, F.A.O. 1986. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in E.coli. Biochem. J. 240: 1-12.

115. Mitraki, A., King, J. 1989. Protein folding intermediates and inclusion body formation. Bio/Technol. 7: 690-697.

116. Schein, C.H. 1989. Production of soluble recombinant proteinsin bacteria. Bio/Technol. 7: 1141-1147.

117. Taylor, G., Hoare, M., Gray, D.R., Marston, F.A.O. 1986. Size and density of protein inclusion bodies. Bio/Technol. 4: 553-557.

118. Anfmsen, C.B. 1973. Principles that govern the folding of protein chains. Science 181:223-230.

119. Achareya, A.S., Taniuchi, H. 1982. Implication of the structure and stability of disulfide intermediates of lysozyme on the mechanism of renaturation. Mol. Cell. Biochem. 44: 129-148.

120. Greighton, Т.Е. 1986. Disulfide bonds as probes of protein folding pathways, pp. 83-106. In: C.W.H. Hirs (ed.), Methods in Enzymology, vol. 131. Academic Press, New York.

121. Greighton, Т.Е. 1990. Protein folding. Biochem. J. 270: 1-16.

122. Freedman, R.B., Hillson, D.A. 1980. Formation of disulfide bonds, pp. 157-212. In: R.B. Freedman and H.C. Hawkins (eds.), The enzymology of post-translational modification of proteins, vol. 1. Academic Press, London.

123. Gierasch, L.M., King, J. 1990. Protein folding. American Association for Advances in Science, Washington.

124. Harrison, S.C., Durbin, R. 1985. Is there is a single pathway for the folding of a polypeptide chain? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4028-4030.

125. Jaenicke, R. 1988. Is there a code for protein folding?, pp. 16-36. In: R. Huber and E.L. Winnaker (eds.), Protein structure and protein engineering, vol. 39. Springer-Verlag, Berlin.

126. Jaenicke, R. 1991. Protein folding: local structure, domains and assemblies, pp. 387-396. In: I. Jornvall and G. Gustavsson (eds.), Methods ion protein sequence analysis. Birkhauser Verlag, Basel.

127. Jaenicke, R. 1991. Protein folding: local structure, domains, subunits and assemblies. Biochemistry 30: 3147-3161.

128. King, J. 1986. Genetic analysis of protein folding pathways. Bio/Technol. 4: 297-303.

130. Kim, P.S., Baldwin, R.L. 1982. Specific intermediates in the folding reaction of small proteins and the mechanism of protein folding. Ann. Rev. Biochem. 51: 459-489.144145146147148149150,151.152.153.154.155.156.157.

131. Ahmed, A.K., Schaffer, S.W., Wetlaufer, D.B. 1975. Nonenzymatic reactivation of reduced bovine pancreatic ribonuclease by air oxidation and by glutathione oxidoreduction buffers. J. Biol. Chem. 250: 8477-8482.

132. Saxena, V.P., Wetlaufer, D.B. 1970. Formation of three-dimensional structure in proteins. Biochemistry 9: 5015-5022.

133. Odorzynski, T.W., Light, A. 1979. Refolding of the mixed disulfide of bovine trypsinogen and glutathione. J. Biol. Chem. 254: 4291-4295. Anderson, W.L., Wetlaufer, D.B. 1976. The foldingpathwayof reduced lysozyme. J. Biol. Chem. 251: 3147-3153.

134. Grigorenko V, Andreeva I, Borchers T, Spener F, Egorov A. A genetically engineered fusion protein with horseradish peroxidase as a marker enzyme for use in competitive immunoassays. Anal Chem. 2001 Mar 15; 73(6), 1134-9.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения пероксидазы хрена включает гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией и осаждение белков сульфатом аммония. Осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера, с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере. Затем продолжают очистку в 0,01-0,03 М растворе МОРS-NаОН буфера на колонке с КМ-целлюлозой при значениях pH и pK буферов 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно. Очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, а затем лиофилизируют. Способ обеспечивает упрощение получения высокоочищенной пероксидазы хрена и повышение ее выхода. 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, а именно к получению высокоочищенной пероксидазы хрена адсорбционной хроматографией.

Высокоочищенная пероксидаза хрена (критерий очистки А 403 /А 275 3,1 - RZ от Reinheitszahl - показатель чистоты) - один из наиболее востребованных ферментов для биохимии и биотехнологии. В частности, она широко используется в методах иммуноферментного анализа, например, для определения ВИЧ-инфекции, гепатитов и других социально значимых заболеваний человека.

Известен способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой или солевым раствором, фракционирование экстракта сульфатом аммония, очистку гель-фильтрацией, спиртовым осаждением, переосаждением хлоридом аммония, фильтрацией через сефадекс G-50, ионообменной хроматографией и диализом .

Недостатками этого способа являются сложность и продолжительность получения, сравнительно низкая чистота полученного препарата (RZ~2,7), трудность получения большого количества фермента.

Известен также способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, фракционирование экстракта сульфатом аммония, гель-фильтрацию .

Недостаток этого способа заключается в низком выходе фермента, низкой его чистоте.

Задачей данного изобретения является повышение выхода высокоочищенного фермента при упрощении способа производства.

Поставленная задача решается тем, что предложен способ получения пероксидазы хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией, осаждение белков сульфатом аммония, диализ осадка белков против 0,01-0,03 М раствора TEA (триэтаноламин)-HCl буфера, последовательную очистку пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, а затем в 0,01-0,03 М растворе MOPS(N-морфолинопропансульфоновая кислота)-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой, при значениях pH и pK буферов, близких к изоточке целевого продукта, и концентрации, обеспечивающей движение пероксидазы вниз по колонке, по принципу адсорбции-десорбции, со скоростью, меньшей, чем у части балластных белков, имеющих одноименный заряд с зарядом на колонке, тогда как другая их часть остается на старте вследствие ионного обмена; раствор очищенного целевого продукта диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl с последующей лиофилизацией, причем фермент после гомогенизации корней экстрагируют водой, сульфат аммония вносят в концентрации 70-75% от насыщения, а значения pH и pK буферов составляют 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно.

Отличием данного способа является одновременное использование одного и того же носителя для адсорбционной хроматографии целевого продукта и для очистки от балластных белков, при значениях pH, близких к изоточке целевого продукта, а также использование буферов небольшой концентрации со значениями pK, близкими к изоточке фермента, причем компоненты буферов имеют объемистые электронодонорные или электроноакцепторные группы, конкурирующие за адсорбент с группами макромолекулы пероксидазы. Пероксидазу хрена получают из сока корней хрена, собранных в самом начале цветения, в это время содержание фермента в корнях в 3-4 раза выше, по сравнению с прототипом.

Техническим результатом решения задачи является получение пероксидазы с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента (субстрат 4-аминоантипирин) за одну стадию. Выход фермента 3,2 г из 100 кг корней, что в 6 раз выше по сравнению с прототипом. Предложенный способ позволяет уменьшить число стадий и за счет этого снизить время на получение целевого продукта и увеличить в 1,5-2 раза его выход.

Известно, что адсорбция белков на каком-либо сорбенте связана с различными нековалентными взаимодействиями макромолекулярных групп с поверхностью этого сорбента. Однако их суммарная энергия мала по сравнению, например, со связыванием белок-ингибитор при аффинной хроматографии или ионными взаимодействиями на ионообменнике. Таким образом, адсорбционное взаимодействие маскируется другими, более сильными взаимодействиями поверхность белка-поверхность носителя. Поэтому, если предполагается очистить данный белок адсорбционной хроматографией, необходимо создать такие условия, чтобы балластные белки либо связывались на колонке, либо двигались по ней быстрее целевого белка, т.е. чтобы только данный белок мог медленно двигаться по принципу адсорбции-десорбции. Такие условия создаются, если использовать в качестве носителя для адсорбционной хроматографии целлюлозу, а для очистки от балластных белков использовать ДЭАЭ- и КМ-группы. Для того чтобы добиться одновременного движения целевого фермента по принципу адсорбционной хроматографии, а части балластных белков - вследствие отталкивания заряженного белка от одноименно заряженных групп, необходимо совместить эти группы и целлюлозный носитель, т.е. использовать ДЭАЭ- и КМ-целлюлозы. Если проводить хроматографию при значениях pH, близких к изоточке целевого фермента, часть балластных белков задерживается на старте вследствие ионного обмена, а часть быстро движется вниз из-за взаимодействия с одноименными зарядами ионообменника. Незаряженный или слабо заряженный фермент будет медленно двигаться, по сравнению с балластными белками, вниз и на ДЭАЭ- и на КМ-целлюлозах в случае конкуренции между группами фермента и компонентами буфера за сорбент.

Буфер имеет:

1) небольшую концентрацию, поскольку при ее повышении конкуренция компонентов буфера может быть столь сильной, что целевой продукт будет двигаться со скоростью, сравнимой со скоростью движения балластных белков, и очистки не произойдет;

2) поскольку буфер должен обеспечить устойчивое значение pH при небольшой концентрации, он должен иметь pK, близкое к изоточке целевого продукта;

3) компоненты буфера должны иметь объемистые группы для эффективной конкуренции с поверхностными группами целевого продукта. Балластные белки будут заряжены при этом значении pH и, в зависимости от заряда, либо остаются на старте («ионный обмен»), либо движутся значительно быстрее целевого продукта (взаимодействие одноименных зарядов). Незаряженный или слабо заряженный целевой продукт будет отделяться и от белков, остающихся на старте, и от быстро движущихся белков. Лишь белки, имеющие изоточки, близкие к изоточке пероксидазы, могли бы связываться адсорбционно и тем самым уменьшать степень очистки, но, как показывает опыт, такие белки в соке из корней хрена отсутствуют или находятся в минорном количестве.

Очистка целевого продукта:

1) белки из сока корней хрена после их гомогенизации экстрагируют водой, доводят ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают сульфатом аммония, диализуют против воды, а затем против 0,01-0,03 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,1-7,4 и наносят последовательно на колонки с ДЭАЭ-целлюлозой в Cl - -форме и КМ-целлюлозой в Na + -форме, уравновешенные соответственно 0,01-0,03 М ТЕА-HCl и 0,01-0,03 М MOPS-NaOH буферами, pH 7,1-7,4 (pK буферов 7,5 и 7,6; изоточка пероксидазы 7,2);

2) за медленным движением коричневого кольца фермента следят визуально;

3) после выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01-0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01-0,03 М NaCl и лиофилизируют;

4) измеряют значения RZ продукта и его активность по 4-аминоантипирину.

Для измерения пероксидазной активности в кювету вносят 1,5 мл фенол-аминоантипиринового раствора (810 мг фенола растворяют в 40 мл воды, добавляют 25 мг 4-аминоантипирина и разбавляют водой до 50 мл), 1,4 мл раствора пероксида водорода (1 мл 30% H 2 O 2 разбавляют водой до 100 мл; далее 1 мл этого раствора разбавляют 0,2 М калий-фосфатным буфером, pH 7,0 до 50 мл), 0,1 мл раствора фермента. Измерение оптической плотности проводят при 510 нм и температуре 25°С. Определяют скорость из линейной части кривой:

ед/мг=( А 510 /мин)/6,58×мг фермента/мл.

Концентрация фермента равна: мг фермента/мл=А 403 ×0,44.

Следующие примеры иллюстрируют эти положения.

Пример 1. 100 кг корней хрена двухлетнего возраста, собранных в начале цветения, промывают водой, гомогенизируют, экстрагируют фермент водой, концентрируют ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают белок сульфатом аммония (70% насыщения). Осадок растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против нее, а затем против 0,01 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,1. Концентрацию белка доводят до 80 мг/мл концентрированием ультрафильтрацией (определение белка по Бредфорд или Лоури) и наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М ТЕА-HCl буфером, pH 7,1 и pK 7,5. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,1 и pK 7,5. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01 М NaCl и лиофилизируют.

Пример 2. 100 кг корней хрена двухлетнего возраста, собранных в начале цветения, промывают водой, гомогенизируют, экстрагируют фермент водой, концентрируют ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают белок сульфатом аммония (75% насыщения). Осадок растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против нее, а затем против 0,03 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,4. Концентрацию белка доводят до 80 мг/мл концентрированием ультрафильтрацией и наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,03 М ТЕА-HCl буфером, pH 7,4, pK 7,6. Далее хроматографируют целевой продукт, как в примере 1, на КМ-целлюлозе, но в 0,03 М MOPS-NaOH буфере, pH 7,4, pK 7,6. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,03 М NaCl и лиофилизируют.

Выход: 3,2 г пероксидазы с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину.

Пример 3. 15 г лиофилизированного порошка пероксидазы с RZ 0,3 суспендируют в 0,01 М TEA-HCl буфере, pH 7,1 центрифугируют (20 мин, 3000 г) и 300 мл супернатанта наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную тем же буфером. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,1, pK 7,5. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01 М NaCl и лиофилизируют.

Пример 4. 15 г лиофилизированного порошка пероксидазы с RZ 0,3 суспендируют в 0,03 М TEA-HCl буфере, pH 7,4, центрифугируют (20 мин, 3000 г) и 300 мл супернатанта наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную тем же буфером. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,03 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,4, pK 7,6. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,03 М NaCl и лиофилизируют.

Выход составляет 1,5 г целевого продукта с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину.

Таким образом, предлагаемый способ в сравнении с прототипом позволяет получить целевой продукт с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину. Выход фермента составляет 3,2 г на на 100 кг корней, что превышает выход по прототипу ~ в 6 раз. Кроме того, полученный целевой продукт обладает большей чистотой по сравнению с прототипом (RZ соответственно 3,35 и 2,7). Упрощение способа выражается в сокращении биохимических стадий с четырех до одной. Этот способ позволяет также выделять высокоочищенную пероксидазу из лиофильно высушенного низкоочищенного фермента.

Источники литературы

1. Paul К.G. The Enzymes. New York, Acad. Press, 1963.

2. Патент РФ № 2130070.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения пероксидазы хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией, осаждение белков сульфатом аммония, диализ осадка, отличающийся тем, что осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, а затем в 0,01-0,03 М растворе MOPS-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой, при значениях pH и pK буферов, близких к изоточке целевого продукта 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно, очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, а затем лиофилизируют.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент после гомогенизации корней экстрагируют водой.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что сульфат аммония вносят в концентрации 70-75% насыщения.